Perbezaan Antara Sequencing Sanger dan Pyrosequencing
Share
Perbezaan Utama - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Penjujukan DNA sangat penting untuk analisis DNA kerana pengetahuan tentang susunan nukleotida yang betul di rantau DNA tertentu mendedahkan banyak maklumat penting mengenainya. Terdapat kaedah penjujukan DNA yang berlainan. Penyusunan Sanger dan Pyrosequencing adalah dua kaedah penjujukan DNA yang berbeza digunakan secara meluas dalam Biologi Molekul. Perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan Pyrosequencing ialah Penjujukan Sanger menggunakan dideoxynucleotides untuk menamatkan sintesis DNA untuk membaca urutan nukleotida sementara pyrosequencing mengesan pelepasan pirofosfat dengan memasukkan nukleotida dan mensintesis urutan pelengkap untuk membaca susunan yang tepat urutan.
KANDUNGAN
1. Gambaran Keseluruhan dan Perbezaan Utama
2. Apakah urutan Sanger
3. Apa itu Pyrosequencing
4. Side by Side Comparison - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Ringkasan
Apakah urutan Sanger?
Penjujukan Sanger adalah kaedah penjujukan DNA generasi pertama yang dibangunkan oleh Frederick Sanger dan kolejnya pada tahun 1977. Ia juga dikenali sebagai Urutan Penghapusan Rantai atau Penjujukan Dideoxy kerana ia berdasarkan penamatan rantai oleh dideoxynucleotides (ddNTPs). Kaedah ini digunakan secara meluas selama lebih dari 30 tahun sehingga Pengenalan Generasi Baru (NGS) telah dibangunkan. Teknik penjujukan Sanger membolehkan penemuan susunan nukleotida yang betul atau lampiran fragmen DNA tertentu. Ia didasarkan pada pemilihan terpilih ddNTPs dan penamatan sintesis DNA semasa dalam vitro Replikasi DNA. Ketiadaan kumpulan 3 'OH untuk meneruskan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida bersebelahan adalah ciri unik ddNTPs. Oleh itu, sebaik sahaja ddNTP dilekatkan, rantai pemanjangan berhenti dan berakhir dari titik itu. Terdapat empat ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP - digunakan dalam penjujukan Sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA apabila ia dimasukkan ke dalam DNA yang semakin berkembang dan menghasilkan pelbagai panjang DNA pendek. Elektroforesis gel kapilari digunakan untuk mengatur helai DNA pendek dengan saiz mereka pada gel seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 01.
Rajah 1: Elektroforesis gel kapilari DNA ringkas yang disintesis
Untuk dalam vitro replikasi DNA, beberapa keperluan perlu disediakan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, DNA template, primer oligonukleotide, dan deoxynucleotides (dNTPs). Dalam penjujukan Sanger, replikasi DNA dilakukan dalam empat tiub ujian berasingan bersama empat jenis ddNTP secara berasingan. Deoxynucleotides tidak digantikan sepenuhnya oleh ddNTPs masing-masing. Campuran dNTP tertentu (misalnya; dATP + ddATP) dimasukkan ke dalam tiub dan direplikasi. Empat produk tiub berasingan dijalankan di gel di empat telaga berasingan. Kemudian dengan membaca gel, urutan boleh dibina seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 02.
Rajah 02: Penjujukan Sanger
Penjujukan Sanger adalah teknik penting yang membantu dalam banyak bidang biologi molekul. Projek genom manusia berjaya diselesaikan dengan bantuan kaedah berasaskan urutan penjujukan Sanger. Pengurutan Sanger juga berguna dalam penjujukan DNA sasaran, kanser dan penyelidikan penyakit genetik, analisis ekspresi gen, pengenalan manusia, pengesanan patogen, sekuriti mikrob dll.
Terdapat beberapa kelemahan penjujukan Sanger:
- Panjang DNA yang diasingkan tidak boleh lebih daripada 1000 pasangan asas
- Hanya satu helai yang boleh dijujukan pada satu masa.
- Prosesnya memakan masa dan mahal.
Oleh itu, teknik penjujukan canggih baru telah dibangunkan dengan masa untuk mengatasi masalah ini. Walau bagaimanapun, penjujukan Sanger masih digunakan kerana keputusan yang sangat tepat sehingga kira-kira 850 serpihan panjang pasangan asas.
Apa itu Pyrosequencing?
Pyrosequencing adalah teknik penjujukan DNA novel berdasarkan "penjujukan oleh sintesis". Teknik ini bergantung pada pengesanan pelepasan pyrophosphate apabila penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim berbeza: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin.
Proses ini bermula dengan primer yang mengikat dengan templat DNA tunggal yang terdirus dan polimerase DNA memulakan penggabungan nukleotida yang melengkapinya. Apabila nukleotida bergabung bersama (polimerisasi asid nukleik), ia mengeluarkan kumpulan pyrophosphate (dua kumpulan fosfat) dan tenaga. Setiap tambahan nukleotida mengeluarkan kuantiti equimolar pirofosfat. Pyrophosphate ditukar kepada ATP oleh ATP sulfurylase di hadapan substrat APS. ATP yang dihasilkan mendorong luciferin penukaran luciferase-mediated kepada oxyluciferin, menghasilkan cahaya yang kelihatan dalam jumlah yang berkadar dengan jumlah ATP. Cahaya dikesan oleh alat pengesan foton atau oleh photomultiplier dan mencipta satu program. Apyrase merendahkan ATP dan dNTP yang tidak diperbadankan dalam campuran reaksi. Tambahan dNTP dilakukan sekali pada satu masa. Oleh kerana penambahan nukleotida diketahui mengikut penggabungan dan pengesanan cahaya, urutan templat dapat ditentukan. Pyrogram digunakan untuk menjana urutan nukleotida DNA sampel seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 03.
Pyrosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan penjujukan DNA pendek. Ketepatan yang tinggi, fleksibiliti, kemudahan automasi dan pemprosesan selari adalah kelebihan pyrosequencing terhadap teknik penjujukan Sanger.
Rajah 03: Pyrosequencing
Apakah perbezaan di antara Sequencing Sangu dan Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing | |
| Penjujukan Sanger adalah kaedah penjujukan DNA berdasarkan penggabungan selektif ddNTPs oleh polimerase DNA dan penamatan rantaian. | Pyrosequencing adalah kaedah penjujukan DNA berdasarkan pengesanan pyrophosphate release apabila penggabungan nukleotida. |
| Penggunaan ddNTP | |
| ddNTPs digunakan untuk menamatkan replikasi DNA | ddNTPs tidak digunakan. |
| Enzim yang terlibat | |
| Polimerase DNA digunakan. | Empat enzim digunakan: DNA polimerase, ATP sulfurylase, Luciferase dan Apyrase. |
| Substrat Digunakan | |
| APS dan Luciferin tidak digunakan. | Adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin digunakan. |
| Suhu Maksimum | |
| Ini adalah proses perlahan. | Ini adalah proses yang pantas. |
Ringkasan - Urutan Sangu vs Pyrosequencing
Penjujukan Sanger dan Pyrosequencing adalah dua kaedah penjujukan DNA yang digunakan dalam biologi molekul. Pengurutan Sanger membina urutan nukleotida secara berturut-turut dengan menamatkan pemanjangan rantai sementara pyrosequencing membina urutan yang tepat dari nukleotida secara berturut-turut dengan memasukkan nukleotida dan mengesan pembebasan pirofosfat. Oleh itu, perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan Pyrosequencing ialah penjujukan Sanger berfungsi pada penjujukan oleh penamatan rantaian sementara pyrosequencing berfungsi pada penjujukan oleh sintesis.
Rujukan:
1. Fakruddin, Md, dan Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-An Alternatif untuk Sequencing Sanger Tradisional." Jurnal Biokimia dan Bioteknologi Amerika. Penerbitan Sains, Mac 02, 2012. Web. 28 Feb. 2017.
2. "Penjujukan Sanger." Penjujukan Sanger - Topik SainsDirect. N.p., n.d. Web. 28 Feb. 2017
Image Courtesy:
1. "Didesoxy-Method" Oleh Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) melalui Wikimedia Commons
2. "Sanger-DNA-seq" Oleh Enzo di bahasa Poland Wikipedia (CC BY-SA 3.0) melalui Wikimedia Commons
3. "Pyrosequencing" oleh microbiologybytes (CC BY-SA 2.0) melalui Flickr
